3GプラントPCR キット

白葉枯病菌からの多糖などの混入があっても、PCR増幅ができる可能性がある。
結果が、安定しなかったため、途中で諦めてしまった。

これまでは、トマト黄化葉巻ウイルスの感染有無を調べるためにDNAを抽出して市販のPCR試薬でPCRをかけていた。
一度に多くの試料を検定するにあたって時間や手間、そしてコストがかかる従来法に比べて、MyTaqTM Plantキットを用いた植物試料からのダイレクトPCRは非常に簡便で安定した結果を得ることができた。
試料採集においては、切断したチップ先を用いて植物葉をパンチする方法、爪楊枝で葉を突いて反応液内に解す方法、そして葉をFilter paperにブロッティングすることで汁液が付いたペーパーの破片を使う方法を試してみた。
いずれの方法においても羅病葉からのみで陽性反応が見られたが、中でも爪楊枝法で最も簡易に核酸を得ることができた。
爪楊枝法とMyTaqTM Plantキットの組み合わせにより、多検体の効率的な検定とともに、病原ウイルスを検定する研究において最も懸念されるコンタミネーションを防ぐこともできる。
今後、他の植物に発生しているDNAウイルスの検定にも有効であるかどうかの検討を進めていきたい。

これまでは、罹病植物から分離した菌体あるいは菌体DNAを用いてQOI検定を行う必要があった。
しかしながら、KAPA3G Plant PCR Kitを使用することで、菌を分離すること無くQOI検定ができ、多検体の効率的な検定と、菌の分離が困難なサンプルの検定が可能となった。
加えて、感受性菌と耐性菌が混在したサンプルからもキメラとして検出することができるため、耐性菌の密度が低い圃場からも、早期に検出できる極めて有効な方法であった。

ナス科植物ペチュニアの芽生え96個体の子葉からゲノムDNAテンプレートを調製し、PCRによってジェノタイピングを行った。
複数遺伝子の遺伝的連鎖を観察するため、多検体に対して複数のプライマーセットで増幅を行い、安定な結果を得る必要があり、そのためのテンプレート調製方法や反応ボリュームの最適化を行った。
本法で作製したテンプレートを用い、1ヶ月以上安定な増幅が可能であったので、多数の遺伝子の連鎖を解析することができた。
これまで他社キットでは安定に増幅しなかったが、KAPA3G Plant PCR キットでは、プライマーペアの間で増幅にばらつきが小さく、安定していて使いやすい。

真核生物の遺伝子をターゲットにするのが初めてで、増幅しにくいゲノムでした。
また、ゲノムDNA精製等々の面で苦労していましたため、KAPA3G Plant PCRキットによるコロニーダイレクトPCR検出を試してみました。
Enhancerを添加したために反応液組成を調製するのが多少面倒でしたが、クルードサンプルに対してもエラーを出さずに正確な増幅が確認できました。
増幅配列をシーケンシングしたところ、配列のGC含量は52.2%と、そう高くない配列ではありましたが、配列中にはポリA配列を含むイントロンも存在し、遺伝子が分断された状態でした。
このような複雑な配列でもKAPA3G Plant PCRキットによるダイレクトPCRで増幅できていたものと思われます。

これまでは、DNAの抽出キットを使用し、市販のPCR試薬でPCRを掛けていました。
サザンブロッティングなど大量にDNAが必要な場合はそれでも良いのですが、タイピングでわざわざDNAを抽出するのは手間でした。
従来法で約90分かかっていた前処理がこのキットなら、サンプルをダイレクトにチューブに入れるだけなので、簡単です。
また、液体窒素中で組織を粉砕する必要が無いため、液体窒素が無くても組換え植物体の選抜が可能です。

従来法ではトータルの処理時間は約100分を要していた。これに対して、KAPAでは約60分で処理を行える。
結果、目的の遺伝子を保持した形質転換BY-2を、簡便に選抜することができた。