ブルーピッピン

PacBioは非常に長いシークエンスを得られますが、この長所を生かすにはインサートの長いライブラリを作成することが必要です。
BluePippinは、短いライブラリを除去し、長いライブラリのみを回収するのに非常に有用であり、シークエンス結果も良好です。
現在、私たちのプロトコルではBluePippinによるサイズセレクションは不可欠なステップになっています。

PippinPrepはC社抽出装置よりも回収率は約3割高くなり、抽出サンプルの回収純度および効率が非常に良かった。
ゲル切出しよりも大幅な作業時間の短縮を可能にしてくれます。
得られるDNAサイズの再現性も高く、安定したシーケンシングが大いに期待できます。

Nextera Mate Pair Library のサイズセレクションでBluePippinを使用しました。
今まではマニュアル操作でゲル抽出を行っていましたが、作業が煩雑で手間と時間がかかり困っていました。
BluePippinを用いることで、実作業時間が大幅に短縮できました。
抽出できたDNA量は少なめでしたが、問題無く使用でき、解析でMate Pairの効果も得られ、scaffold数を大幅に減らせました。
今回マニュアル抽出との同時比較はしていませんが、データ解析の結果も十分なものが得られ、遜色無いと判断できました。
作業効率と精度を考えると、BluePippinでの自動化は効果的だと思いました。

PippinPrepで分画したライブラリーの方が、精度と再現性が高かった。
機器操作も非常にシンプルで直感的に使用できるのが良い。

Ion Torrent PGMのシークエンステンプレート調製におけるエマルジョンPCRはライブラリーのインサート長に非常に敏感で、短い断片が混入したり、インサート長が指定より長い場合に目的のライブラリー分子が正しく増幅されず、期待通りのシークエンス結果が得られないことがあります。
PippinPrepによる正確なサイズ分画はPGMの能力を十分活用するためには必須だと思います。最新の400bpシークエンスでもよい結果がでています。

PippinPrepで高分子DNAを除去する事により、リード数（passed filter wells)と平均リード長が向上しました。
コントロールビーズのシーケンス結果を考慮しても、PippinPrepでの高分子除去は、総解読量（total bases）の向上に効果的と考えられます。

BluePippinによるサイズセレクションによって短いライブラリが除去でき、平均リード長 (Subread) がサイズセレクションなしと比べて、≧4kbでは2.6倍、≧7kbでは3.3倍に伸長した。
また、≧7kbのリードの割合は、サイズセレクションなしでは5%、≧4kbでは38%、≧7kbでは51%となり、長いリードの割合が増加した。
さらにセルあたりのデータ量は、サイズセレクションなしと比べて、≧4kbでは1.5倍、≧7kbでは1.9倍に増加した。
これらの結果から、PacBio RS IIの最新標準プロトコールとなっているBluePippinによるサイズセレクションは長いリードを得るために必須であり、実際に非常に効果的であった。

PacBioによるlong read性能を活かしてゲノムシークエンスを行うには、長鎖DNAを濃縮したライブラリーを作製することがキーとなる。
BluePippinでの正確な分画により、ヒト組織でのシークエンス長を大きく改善することが出来た。

MatePair 8kb用のDNA抽出で検討しましたが、再現性も高く良好な結果でした。
マニュアルでの手間を考えると、BluePippinでのゲル抽出自動化はNGSライブラリー作製でメリットがあると考えます。
これからいろいろなサンプルで活用していきたいと思います。

BluePippinを用いたサイズセレクションにより、短いリードを取り除くことができ、サイズセレクションしていないサンプル（no data）と比較して、長鎖DNA断片を効率的にシーケンスすることができた。