KAPA HyperPETE Reagent Kit

KAPA HyperPETEは特定領域のキャプチャーにプライマーの伸長反応を応用した画期的なヒト由来NGSライブラリー用ターゲットエンリッチメントキットです。

KAPA HyperPETE (Primer Extension Target Enrichment)

KAPA HyperPETEは、ヒト由来NGSライブラリーを対象としたターゲットエンリッチメントキットです。SNVs、インデル、CNVs、MSI、RNA Fusionなど、多様な遺伝子多型の検出で使用が検証されており、優れたパフォーマンスと簡便なワークフローが、効率的なキャプチャーシーケンスを可能にします。KAPA HyperPETE Reagent Kitには、PETE反応に必要な濃縮、洗浄、その後の PCR 用の試薬が含まれており、KAPA HyperPETE パネル（キャプチャープライマー＆リリースプライマー）と組み合わせて使用することで、KAPA HyperPETEワークフローを実施することができます。ライブラリー調製試薬やアダプターなどが別途必要となります。

反応原理

KAPA HyperPETEでは、Dualインデックス付のDNAライブラリーを作成し、このライブラリーに対しキャプチャー操作を行います。キャプチャーには、キャプチャープライマーとリリースプライマーという二種類のプライマーを使用する独自の方法が採用されていて、これにより目的のターゲット領域を含むライブラリー分子を正確に捕捉します。

　Anchored Multiplex PCRを含むアンプリコン法では、プライマーより伸長した配列がシーケンスされるため、ライブラリー分子の塩基配列は、プライマーに始まる配列に制限されます。一方、KAPA HyperPETEでは、プライマーの伸長反応はターゲット配列が含まれるライブラリー分子の捕捉のみに使用され、補足されたライブラリーの末端ポジションは、プライマーの位置に影響を受けません（元のDualインデックス付のDNAライブラリーでの末端ポジションが維持されます）。このため、KAPA HyperPETEを使用して得られたシーケンスのカバレッジは、プライマーの影響が少ない均一なものになります(図1)。

　また、KAPA HyperPETEでキャプチャーを行った後のライブラリーには、プライマー結合部位が残りません。このため、解析時に、シーケンスデータよりプライマー結合部位の配列を削除する必要がなく、シーケンス効率の向上と、バイオインフォマティクスの作業を簡便化することが期待できます。

図1.APC遺伝子上でのAnchored Multiplex PCR法とKAPAHyperPETEのカバレッジ比較

がん抑制遺伝子adenomatous polyposis coli (APC)のIGV画像。図中の白い部分は非カバレッジ領域を表している。Anchored Multiplex PCR法では、リードの一方の端は特異的プライマーを設計した箇所で固定されるため、カバレッジの均一性が損なわれる。一方、KAPA HyperPETEワークフローでは、プライマーは、ターゲット配列を含むライブラリー分子を捕捉しているだけなので、捕捉された分子の末端にバイアスを生じず、カバレッジの均一性が向上する。

特長

• KAPA HyperPETEは、フォーカスしている少数の遺伝子（DNA: 250 Kbまで、RNA: 50 Kbまで）の低頻度変異のために特に最適化されています。
• cfDNA、FFPE、RNA、Germline、各スターティングマテリアルに応じたプロトコルが準備されています。
• 低頻度の変異を解析するcfDNA、FFPE、RNA用のプロトコルでは、KAPA ユニバーサル UMI アダプターを使用することで分子数を正確に評価します。

用途に応じたキャプチャーパネルが選択可能

• HyperPETE専用パネルとして、カタログパネルおよびカスタムパネルが利用できます。

• すぐに利用できる固定デザインパネルをカタログパネルとして取り扱っています。

体細胞変異解析用 

・KAPA HyperPETE Pan Cancer Panel

・KAPA HyperPETE Hot Spot Panel

・KAPA HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel

生殖系列変異解析用

・KAPA HyperPETE Hereditary Oncology Panel

・KAPA HyperPETE Newborn Screening Panel

• オンラインデザインツールHyperDesignを使用して、カスタムパネルをデザインすることも可能です。
• HyperDesignツールには、ツールを利用して設計するカスタムパネル『KAPA HyperPETE Choice』の他に、HyperDesignツール経由で依頼してRoche社デザイナーが設計するカスタムパネル『KAPA HyperPETE Explore』が用意されています。

・KAPA HyperPETE Choice Panel

・KAPA HyperPETE Explore Panel

・KAPA HyperPETE Choice RNA Panel

・KAPA HyperPETE Explore RNA Panel

自動化に適した、合理的で迅速なワークフロー

• ワークフローの総時間を一般的なハイブリダイゼーションキャプチャー法と比較して短縮することができます（図２）。

図2.KAPAHyperPETEターゲットエンリッチメントの所要時間

(A）他のターゲットエンリッチメント法とのTAT比較。一般的なハイブリダイゼーションベースキャプチャーでは2日かかるのに対し、KAPA HyperPETEワークフローは最短1日で完了できる。これはAnchored Multiplex PCR法と同程度の所要時間である。(B)インプット核酸の違いによるKAPA HyperPETEの所要時間（Turnaroud time:TAT）比較。このTATの違いは、ライブラリー作製時間に依存し、キャプチャー操作自体に要する時間は、いずれの方法でも同じである。

多様なサンプルにおいて優れたパフォーマンスを発揮

血漿中より回収した cfDNA 解析の事例

• 様々なcfDNAインプット量において、高いOn target率と高いエクソンカバレッジ（1000倍以上）を実現（図3）

図3. cfDNA（10 ng および 50 ng インプット）に対してKAPA HyperPETE Hot Spot Panel および KAPA HyperPETE Pan Cancer Panelでエンリッチメントした結果

インプット量、タイプを問わす、深く、広くカバレッジが得られた。On-target率は、KAPA HyperPETE Hot Spot Panelで65%～73%、KAPA HyperPETE Pan Cancer Panelで70%～73%であった。50 ng cfDNA 投入時、1000X以上でカバーされた割合は、KAPA HyperPETE Hot Spot Panel で >99%、KAPA HyperPETE Pan Cancer Panel で 97%-98%であった。3000X以上の割合は、80％～94％および67％～85％であった。10 ngのインプットで見られたユニークデプスは、unique genome equivalents（10 ngのDNAで約3300）と一致し、1000×でカバーされた割合が83～99％（Hot Spot Panel）および80～94％（Pan Cancer Panel）であった。（条件詳細はこちら）

• 血漿中のcfDNAより高感度で変異を検出

表1.市販のctDNA Mutation Mixを使用した変異検出
2種類の市販のctDNA Mutation Mix samplesサンプルを用いて低頻度（アレル頻度1%、5%）のSNVとIndelの検出性能を評価した。10 ng、50 ngのいずれの条件においてもそれぞれのバリアントは高い真陽性率で検出された。（条件詳細はこちら）

FFPE組織検体（FFPET）から回収した RNA 解析の事例

• 幅広いインプット量より、特異性の高いエンリッチメントが可能（図4）

図4.KAPA HyperPETE Lung Cancer Fusion Panelを使用したOn target率の評価結果。FFPET RNAサンプル10ngおよび50ngより、92％〜97％のOn target率達成。

様々な品質（Low、Medium、High quality）のFFPET RNAを10 ngまたは50 ngインプットした結果。その結果、オンターゲット率は92～97%（ハウスキーピング遺伝子およびFusion遺伝子を含む）を示し、すべてのサンプル量、品質、タイプにおいて良好なパフォーマンスであった。（条件詳細はこちら）

• Reference cell lineサンプルにおける融合遺伝子すべてを検出

表2. FFPET RNAを用いた融合遺伝子検出

3種類の市販のRNA Fusion FFPEサンプルを用いて融合遺伝子検出性能を評価した。それぞれのサンプルに含まれる融合遺伝子は10 ng、50 ngのいずれの条件においても全て検出された（100％）。（条件詳細はこちら）

関連製品

KAPA HyperPETEカタログパネル

KAPA HyperPETEカスタムパネル

仕様

Capture Extension Reagent、Release Extension Reagent、KAPA HiFi HotStart Ready Mix tubesは室温（〜25℃）以上の温度に長時間さらさないでください。