NGSライブラリー 定量(LQ) キット

KAPA Library Quantification kitsはメーカーの濃度調製済スタンダード溶液がついているため、簡便で再現性の高い測定が可能です。
それにより期待したリード数を得やすくなりました。

私は、日本ジェネティクスさんが売り出されている一連のKAPA製品と自作のIndex付きアダプターDNAを使うことで、高感度でロバストな微量サンプル（0.1-10ng）対応のmultiplex-library preparation methodを完成させました。
アプリケーションノートの検証では、同スタートマテリアルからライブラリDNAを作製しており、収量・分布・内容にどれだけブレが生じたか調べています。
検証結果を見ていただければ、ライブラリ作製方法が非常に高感度でロバストであることが納得していただけると思います。
検証では100bpの平均サイズ長のゲノムDNAを使用していますが、200bp以上だともっとライブラリ作製効率は高くなります。
同ライブラリ作製方法を使用し、様々なスタートマテリアルから得られたライブラリDNAをHiSeq1000/2000で検出し、良好な結果を得ています。（当実験はMiSeqを使用）
KAPA製品には他社さんには無いアドバンテージが2つあります。
1つ目は、KAPA real-time library amplification kit。PCR-enrichmentでのover-amplificationを未然に防ぎます。
over-amplificationすると、ライブラリDNA同士がくっつき正確なサイズがわからなくなるトラブルが生じますし、余計なPCRバイアスにつながります。
SybrGreen耐性のエンジニアリング酵素なので、得られた指標と成るPCRサイクルはほぼ予想通りの収量を反映します。
2つ目は強力なエンジニアPCR酵素KAPA HiFi DNA polymeraseをはじめとするキットに含まれる酵素の優位性です（各キットのアプリケーションノート参照）。
今回使用したKAPA製品全てにおいて、どのロットも安定して高品質でした。
ネックとなるのは自作アダプターの件だと思います。方法の導入を検討されるのであれば、日本ジェネティクスさんを通じてご連絡ください。
良いシーケンスは、良いライブラリ作製から。皆さんのシーケンスライフが実り多いことを願って。

A社キットを使った場合に比べて、Dilution Factor が高めに出る傾向がありました。
A社の場合とKAPAの場合とで相関係数が高い（0.97）ので、これは使った標準DNAの違いがそのままでていると考えています。
どちらが良いとは判断のしようがありませんので、結果としては、KAPA LQ Kit（SYBRGreenI検出）はA社（蛍光プローブ検出）と同じように定量できるということが言えると思います。
KAPAでのPCRの増幅具合を見ますと、
1）20µLの反応容量にもかかわらず、高い蛍光値を示す。
2）標準DNAの反応パターンから見たPCR効率が高く（97.4%）、ばらつきもほとんどない（R^2 = 1.000）などから、
SYBRが大量に入っていても、力強く増やすことができる酵素、反応系であると感じました。