2. 免疫蛍光染色

免疫蛍光染色をはじめる前に、使用する細胞における対象とするターゲットタンパク質の発現レベルおよび細胞内局在を文献調査で確認するとよいでしょう。タンパク質の中には、特定の細胞株で、極端に発現量が非常に低いものがあります。このような場合、外部からの刺激や、なんらかの過剰発現技術で対象のタンパク質発現を促す必要が生じます。

また、染色に最適な細胞密度も検討しなければなりません。一般に、免疫蛍光染色には70～80%のコンフルエンス状態が推奨されます。 さらに、理想的な細胞培養容器の形状、及び基質/コーティングを選択し、使用する顕微鏡観察法と互換性を持たせる必要もあります。免疫蛍光染色を上手く行うためには、実験全体を通じて、細胞を乾燥させないことも極めて重要です。容器の形状を選択する際には、この点も含めて考慮すべきです。

最後に、適切な比較対照群考慮し、染色後、統計学的有意差検定を行うために必要な試料数を前もって計画すべきです。

細胞内のタンパク質を染色するためには、細胞は透過処理を必要とします。この段階がなければ、抗体が脂質膜を通って細胞内に入ることはできません。透過処理には、PBS溶液中でのTritonX-100や(透過性がそれほど強くない)Tween-20などの界面活性剤中にインキュベーションします。 この透過処理でも、対象となるタンパク質、使用した抗体、実験条件に応じて最適化が必要になります。膜タンパク質を染色する際には、Triton X-100が細胞膜を壊す可能性があります。このため、膜タンパク染色には、サポニンを用いる場合があります。アルコールは細胞膜の脂質を容易に洗い流すので、メタノール固定したサンプルは、透過処理済である点はご注意ください。

この段階を経た後、洗浄液で5分間、3回洗浄しなければなりません。

一次抗体およびその抗原抗体反応条件の選択は、免疫蛍光染色プロトコルの最も重要なステップです。特に、研究室でまだプロトコルが確立されていない場合には、事前の文献調査が極めて重要です。適切な一次抗体は、対象となる抗原に対して高い特異性を有していなければなりません。さらに、その抗体がモノクローナルかポリクローナルかがその特異性に影響します。多くの抗体メーカーは、免疫蛍光染色で有効であった抗体に関する参考文献を製品ページに掲載しているのでこちらを活用するといいでしょう。

一次抗体でもう一つ確認するべき点は、どの生物に由来するかという点です。この一次抗体のホストで、使用する二次抗体が決まります。このことは、多色染色を行う場合に特に重要です。なぜなら、多重染色する場合、そこで使用する一次抗体は、交差反応を避けるために、それぞれホストが異なっていなければならないからです。 最適な反応条件は実験ごとに慎重に決定しなければなりません。抗体濃度が高すぎてインキュベーション時間が長すぎると、非特異的なバックグラウンドシグナルを生じる可能性があります。逆に、濃度が低すぎる場合や、インキュベーション時間が短すぎる場合には、シグナルが非常に弱くなり、最悪見えない可能性もあります。

一次抗体の抗原抗体反応が終わった後には、試料を洗浄液で5分間、3回洗浄し、バックグラウンドの原因となる未反応の抗体を洗い流します。

顕微鏡観察前の最終段階は、核の対比染色とサンプルの封入です。試料の乾燥を避け、安定した屈折率を得るためには、試料をマウント剤で封入する必要があります。 マウント剤には自家蛍光の低いものを使用してください。DAPIは、核の標準染色試薬であり、マウント剤にあらかじめ含まれており、封入する作業だけでDAPI染色できるものがあります。DAPI染色を別途追加することもできます。