ライトサイクラー RNAマスター ハイブリダイゼーションプローブ

特長

• ready-to-useのホットスタート反応ミックス
• ライトサイクラー2.0 インスツルメントとHybProbeプローブを検出フォーマットとして利用した、キャピラリー中での1ステップRT-PCRに特に適合
• ホットスタートは、Tth DNAポリメラーゼとアプタマーの組み合わせを使用することで達成
• 簡便で高性能、また再現性が高くコンタミの危険性も最小限に
• テンプレートRNA、HybProbeプローブ、(必要なら)Mn(OAc)₂を加えるだけ
• 特にライトサイクラー機器での使用にデザイン
• キャリーオーバーの防止のために、熱不安定性ウラシルDNAグリコシラーゼとの組み合わせで使用可能

背景

ライトサイクラーRNAマスターハイブプローブはready-to-useのホットスタート反応ミックスです。ライトサイクラー2.0 インスツルメントとHybProbeプローブを検出フォーマットとして利用した、キャピラリー中での1ステップRT-PCRに特に適合しています。

ホットスタートは、Tth DNAポリメラーゼとアプタマーの組み合わせを使用して達成されます。

Tth DNAポリメラーゼは、RNA依存性リバーストランスクリプターゼとDNA依存性ポリメラーゼ活性を持つ熱安定性酵素で、一本のチューブでのRTとPCRの組み合わせを可能にします。

アプタマーは特定のオリゴヌクレオチドで、ポリメラーゼの活性中心に結合し、Tth酵素の至適な反応温度以下での、酵素への核酸ターゲットの付着を防ぎます。より高い温度でアプタマーは酵素から離れ、RTやDNAの重合が開始されます。アプタマーによるホットスタートは、その他にいかなるインキュベーションステップやピペッティングステップ、反応時間の延長も必要としないため、非常に効率的で簡便な方法です。アプタマーによるホットスタート操作法は、他の酵素過程、増幅産物のオンライン検出やその後の操作ステップに干渉しません。

それゆえ、反応のセットアップやRTステップの前の熱フェーズの間、プライマーの伸長が起こりません。それに加え、Tthでの逆転写の推奨されるインキュベーション温度(61℃)は、RNAの二次構造を克服します。これにより高度に特異的で効率的なcDNA合成と、その後の高度に特異的で高感度なPCRの結果が得られます。

HybProbeプローブはPCRのアニーリング相の間で、増幅断片の内側にハイブリダイズする2種類の短いオリゴヌクレオチドより構成されます。
一方のプローブは5'-末端がライトサイクラーRED(LC-Red 640かLC-Red 705)で標識され、伸長を防ぐため3'-末端がリン酸化されています。
他方のプローブは3'-末端がフルオレセインで標識されています。2つのプローブが近接してハイブリダイズした後にのみ、蛍光物質間に蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)が起こります。
FRETの間に、ドナー色素であるフルオレセインはライトサイクラーの光源により励起され、その励起エネルギーの一部をアクセプター色素であるライトサイクラーREDに転移します。ライトサイクラーREDのエミッションを測定します。

LC Red 640とLC Red705を標識したHybProbeプローブはそれぞれ独自に、あるいは組み合わせても使用でき、一色や二色検出が可能です。一色検出を行う時、色較正は必要ありませんが、LC Red 640とLC Red 705を標識したHybProbeプローブの二つを1本のキャピラリーで使用する二色検出実験を行う場合は、色較正ファイルの使用が要求されます。色較正はライトサイクラー機器の稼動の間やその後で行うことが出来ます。

色較正ファイルの作成と使用に関しては、色較正セットの能書の更なる情報やライトサイクラー * オペレーターマニュアルを参照してください。
このキットは、RTステップ間の高いインキュベーション温度が二次構造の問題を克服し、ホットスタートがRT間のミスプライミングを最少にするため、困難なRNAポピュレーションに最適です。更に一塩基多型(SNPs)やミューテーションの分析に使用できます。

ライトサイクラーRNAマスターハイブプローブは、簡便、高性能で再現性が高く、コンタミネーションの危険性を最小限にします。ただテンプレートRNA、HybProbeプローブ(もし必要なら)Mn(OAc)₂を加えるだけです。

機能試験

本キットはライトサイクラーコントロールキットを用いて機能試験されています。

キット内容

1. ライトサイクラーRNAマスターハイブプローブ、2.7倍濃度
2. Mn(OAc)₂ストック溶液
3. PCRグレードフィルター滅菌水