プラスミドミニキット

FAQ

使用方法・
技術的内容 形質転換した大腸菌からこのキットを用いてプラスミド抽出を行った場合、 細胞(HEK293細胞で検討しています)へのトランスフェクションに耐えうる精製度は得られますでしょうか？ すなわちエンドトキシンレベルはどの程度になりますでしょうか？ もちろんトランスフェクションを行う場合はエンドトキシンフリーな精製を行うのが一般的かと存じます。 最終的にはそのように行っておりますが、上記製品を用いた培養細胞へのトランスフェクション事例などございましたら、ご多忙の折大変恐れ入りますが、ご教示頂けましたら幸いです。

大変恐れながら、本製品に関しましては「シーケンスグレード」として開発されましたため、一般的なPCR、制限酵素、サイクルシーケンスなどの酵素反応で問題がないかどうかは検討しておりますが、エンドトキシンレベルについては検討されておりません。 もともと特にエンドトキシンを除去するような仕様になっておりませんので、エンドトキシンレベルは、 おそらく精製時の諸条件（菌株の種類、培地の種類、菌体ペレット量など）により、左右されることが予想されます。 従いまして、特に条件によって結果が影響を受けやすいトランスフェクションでは、安定して再現性高い結果を得るためには、おっしゃるとおり「トランスフェクショングレードのプラスミド精製キット」をご使用いただくことをお勧めいたします。 ご期待にそえる回答とはならず、大変恐縮に存じます。 なお、ご参考までに、実例としましては、本キットで精製したプラスミドをHEK293のトランスフェクションにルーチンで使用されているお客様のお話はお伺いしたことがございます。 また、実際に私どもの社内テストでもHEK293で問題なくトランスフェクションが可能でした。 HEK293は、比較的上手く行きやすいかもしれません。

使用方法・
技術的内容 FastGene Plasmid Mini Kitに関してですが、 このキットで精製したプラスミドを細胞株にトランスフェクションしようと考えております。 トランスフェクション試薬の取扱説明書には、プラスミド精製の際に endotoxinが混入すると導入効率が下がると記載されています。 このキットで精製したプラスミドにはendotoxinが混入するでしょうか？

まず初めに、FastGene Plasmid Mini Kitを使用した場合に限らず、「大腸菌から精製したプラスミドDNA」には、 endotoxinが含まれる可能性がございます。 ただし、使用する精製キットの精製原理などの違いにより、endotoxinが含まれるレベルは異なってまいります。 FastGene Plasmid Mini Kitなどのシリカメンブレンを用いたスピンカラム式の市販キットは、簡便に精製できる 反面、陰イオン交換カラム式のキットなどに比べますと、得られるプラスミドの純度が高くないため、 endotoxinが混入するリスクがございます。 なお、トランスフェクションに用いる細胞や条件によっては、本キットで精製したプラスミドでも問題なく トランスフェクションが実施できる可能性もございます。（弊社でも実際に可能であることを確認しております。） ですので、本キットで精製したプラスミドをトランスフェクションに用いる場合には、予備実験などであらかじめ 問題なくご使用いただけるかどうかご確認いただくことをお勧めいたします。 あるいは、このendotoxinの影響を可能な限り排除したい場合には、本キットよりも高純度にプラスミドDNAを 精製できる「陰イオン交換カラムによるプラスミド精製キット」であるFastGene Xpress Plasmid PLUS kitで 精製したプラスミドDNAをご使用いただくことをお勧めいたします。 （詳細） エンドトキシンは、主にバクテリアの細胞壁を構成するリポポリサッカライドを指しておりまして、 「バクテリアである大腸菌からプラスミドを精製する」以上は、どのような精製手法を用いましても、 このエンドトキシンが混入するリスクがございます。 そして、細胞の種類によっては、このエンドトキシン（リポポリサッカライド）を毒素として感受性を示します。 この感受性のレベルは、細胞の種類やトランスフェクションの諸条件によって異なってまいります。 エンドトキシンが細胞に影響する場合、最終的にトランスフェクションの結果に影響を与える 可能性があります。 ですので、細胞を用いるトランスフェクションの際には、どのトランスフェクション試薬を用いる場合でも、 プラスミドの純度を考慮することが必要となります。 なお、精製したプラスミドDNAへのエンドトキシンの混入のレベル（プラスミドDNAの純度）は、 精製方法（精製キット）により異なってまいります。 以下は一般的なプラスミド精製キットの種類ですが、番号が大きいほど純度が高く、エンドトキシン混入の リスク（レベル）が小さくなります。FastGene Plasmid Mini Kitは、（1）に該当します。 　（1）シリカメンブレンを用いたスピンカラムによるプラスミド精製キット 　　　　⇒細胞や条件によっては、トランスフェクションに使用可能です。 　　　　　PCRや酵素反応などには問題なくご使用いただけます。 　（2）陰イオン交換カラムによる高純度プラスミド精製キット（トランスフェクショングレード） 　　　　⇒基本的にトランスフェクションに問題なく使用可能です。 　 　（3）エンドトキシン除去の仕組みを加えた高純度プラスミド精製キット（エンドトキシンフリーグレード） 　　　　⇒エンドトキシンに特に感受性が高い細胞を用いる場合に適します。 トランスフェクションの難易度や、目的などに合わせて、適切な精製キットをご選択いただければ、と存じます。

トラブル
シュート 御社のFastGene Plasmid Mini Kitを使用させていただいております。 MP6を入れて溶出をした後に溶出液を確認すると白くもやもやしたものがたまに入っているのですが、こちらはカラムに起因するものでしょうか？ 何かご存知でしたらお教えください。

可能性としましては、洗浄バッファーｍP5のキャリーオーバーが考えられます。 このバッファーはエタノールを含んでおりますため、溶出バッファーｍP6に混入すると、 界面を形成したり、塩などを析出させたりすることが考えられます。 使用されたプロトコールにより、以下をご確認ください。 （1）Fastプロトコールでのキャリーオーバーの可能性 もしもFastプロトコールの場合、洗浄バッファーの液量が多く、遠心後の廃液面がカラムに近い位置にありますため、何かの拍子にカラムの下部に液滴が付着してしまう可能性があります。 Fastプロトコールでは、その他のプロトコールとは異なり、この後に乾燥ステップがなく、そのまま溶出ステップに進むため、溶出の遠心時に、カラムに付着していた液滴が一緒に落ちてしまい、キャリーオーバーいたします。 この場合、洗浄バッファー遠心後のカラムの廃棄時に、液滴がカラムに付着しないようご注意ください。 （2）その他のプロトコールでのキャリーオーバーの可能性 こちらは少し考えにくいのですが、もしも遠心力および遠心時間が不足している場合、洗浄バッファーがキャリーオーバーする可能性があります。 この場合、最後の乾燥ステップで、遠心時間を少し長め（3～4分）に設定ください。

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