カパ・プローブ・ファストqPCRキット

FAQ

使用方法・
技術的内容 ABI7900HT（ファストモードではない）を使ってPCRします。 反応時間は、95℃20秒から3分（1サイクル）、95℃1から3秒、60℃20秒以上（40サイクル）でよろしいでしょうか。 キット同封のプロトコールの4.3に記載されています。 Denatureの時間が短いので、心配です。ファストモードの時間なのでしょうか。

おっしゃるとおり、こちらのプログラムが初期の推奨条件となりまして、基本的には通常のモードも、ファストモードも共通となっております。 もしも「なるべく反応時間を短時間で終了させたい」というご要望がないようでしたら、Denatureについては、Initial denature 95℃ 3分、サイクル中のdenature 95℃ 3秒で設定していただければ、問題ないかと存じます、ご安心ください。 一方、”60℃20秒以上”についは、結果（増幅効率や非特異増幅の有無）によって、最適化が必要な場合があります。 （詳細） リアルタイムPCRを含めて”PCR”では、initial denatureのステップは、テンプレートとなる長鎖DNAを完全に1本鎖に変性する必要があるため、特にゲノムDNAがテンプレートの場合は、長め（3分間）に設定いただいた方が確実です。 しかし、サイクル中は増幅してきた、より短いPCR産物がテンプレートとなるため、より短いdenatureの時間設定でも、PCR産物を1本鎖に変性させることが可能です。 特にリアルタイムPCRの場合、一般的にはPCR産物が200bp前後と短く設計されるため、比較的短時間で十分に変性いたします。 また、PCR中の反応自体も、「設定した時間」に加え、「その前後の温度が移行している時間帯」にも、実際には反応が進んでいます。 　したがいまして、「95℃3秒」で設定した場合でも、実際にはその前後の温度移行中も変性反応は進みます。 ただし、”ファストモード”の場合は、温度の伝達が速いファストブロックを使用するため、通常のブロックの場合と全く同じプログラム設定でも、実際のトータル反応時間は短くなります。（設定前後の温度移行時間帯が短い） これにより、ファストモードのほうがPCRの掛かりが悪くなる場合があります。 （この場合は、設定時間を長くする必要があります。） 本キットの初期推奨条件は、ファストモードに対応しておりますので、通常のモードでは、十分な時間設定となっております。

使用方法・
技術的内容 持ち込めるテンプレート量が250ngまでと記載されていたかと思います。 （もう一度読んでみようと思ったのですが、どこに記載されていたか見つかりません。すみません。） そこで質問なのですが、これはgDNAを想定した量でしょうか。 私どもではcDNAをリアルタイムPCRで定量しています。200bpくらいの長さなのですが、持ち込み量を、もう少し増やしても大丈夫でしょうか。

ABI7900HTで、TaqManプローブなどの蛍光プローブを用いて、ｃDNAを定量されるのでしたら、本キットをご使用いただけるかと存じます。 おっしゃるとおり、本キットのプロトコールの反応組成の表中に「Template DNA　<250 ng」との記載がございます。これはgDNAでも、cDNAでも、同様となります。 また、「200bpくらいの長さなので、持ち込み量を増やしても大丈夫か？」というご質問の意味としましては、 「200bpは少し長めで増幅し難いため、確実に検出するために持ち込み量を増やしたい」ということでしょうか？ もしもこの場合、200bpでしたら特に問題なく増幅は可能ですので、持ち込み量は気にされなくても大丈夫ではないかと存じます。 なお、通常はテンプレート持ち込み量は250ngで十分なのですが、持ち込むcDNA中にターゲットとする配列が極僅かと予想される（発現量が少ない）場合、cDNA持ち込み量をもう少し増やすことは可能かと思います。

使用方法・
技術的内容 Takara Dice Real time system2を使用しています。本製品を使用するにあたりROXの添加は必要でしょうか？

いいえ、ROXを添加頂く必要はございません。マスターミックスをそのままご使用ください。

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