ＫＡＰＡ　ＥｖｏＰｌｕｓ　Ｋｉｔ

KAPA EvoPlus Kitは、アップグレードされた断片化酵素ミックスにより、さまざまな課題を解決します。

特長

• アーティファクト（人工的な変異）の発生を低減
• EDTAなどインヒビターの影響による断片化サイズのばらつきを改善
• フラグメンテーションとAテーリングを統合した簡便なステップ
• 操作時間を短縮（おおよそ２時間）
• サンプルインプットレンジは10 ng ～ 500 ng（PCRフリーライブラリーは 75 ng以上から可能 *）
• プレートフォーマットタイプを新しく追加、完全に自動化可能なワークフロー

*全ゲノムシーケンス、高品質gDNA、ダブルサイズセレクションをしていない、フルレングスアダプターを使用する、などの条件を満たす必要があります。

信頼性の高いシーケンスが得られます

一般的な酵素的断片化によるライブラリー調製ではアーティファクトが必然的に生じますが、KAPA EvoPlus Kitは新しい断片化反応を採用することでアーティファクトの発生を抑制し、物理的断片化による方法と同等の信頼できるシーケンスが取得できます。

■ストランドスプリットアーティファクトリード（SSARs）¹の抑制

KAPA EvoPlus Kit、KAPA HyperPrep Kit、NEBNext® Ultra™ II FS、QIAseq FXで500 ngのヒトゲノムからライブラリーを調製し（ダブルサイズセレクションを実行）、SSARs（キメラリードの1種であり、部分的に連続しないゲノム配列で構成されるリード）¹の割合を調べたところ、NEBNext® Ultra™ II FS、QIAseq FXではSSARsが存在する割合が高くなっているのに対して、KAPA EvoPlusライブラリーに存在するSSARsの割合は、KAPA HyperPrepライブラリー（業界のゴールドスタンダードと見なされます）と同等であり、ゼロに近いことが確認されました（0.002％）。

1: Haile, et al. Sources of erroneous sequences and artifact chimeric reads in next generation sequencing of genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded samples. Nucleic Acids Research, 2019, 47,2. doi: 10.1093/nar/gky1142.

■キメラの抑制

KAPA EvoPlus Kit、KAPA HyperPrep Kit、NEBNext® Ultra™ II FS、QIAseq FXで500 ngのヒトゲノムからライブラリーを調製し（ダブルサイズセレクションを実行）、キメラリードの割合を調べたところ、KAPA EvoPlusライブラリーに存在するキメラの割合はKAPA HyperPrepライブラリー（業界のゴールドスタンダードと見なされています）と同等のレベルで低いことが示されました。

■高い正確性のバリアントコール

コールされた全てのバリアントからSNPsとインデルのPPVs（偽検出と反対の指標であり、高い数値であるほど正確な検出ができることを示します）を調べたところ、KAPA EvoPlus KitによるライブラリーのPPVsはKAPA HyperPrepライブラリー（業界のゴールドスタンダードと見なされます）と同等であることが示されました。

安定したサイズのライブラリーが得られます

KAPA EvoPlus KitではインプットDNAの量やGC含量に関わらず一定のサイズのライブラリーを調製することが可能で、さらに、EDTAなどインヒビターの影響を受けにくくなっています（最大2mMまでのEDTA溶液で同等のライブラリー調製が可能）。
また、反応時間を変えることでライブラリーインサートサイズを調整することも可能です。

■さまざまな投入量で再現性のある酵素的断片化が可能

ヒトゲノムDNA（10 ng、100 ng、500 ng）を37℃で断片化したところ、いずれの条件においてもモードインサートサイズが約300 bpのライブラリーが調製されることが示されました。
この検証実験ではフルレングスアダプター（KAPA UDIアダプター）を用いたKAPA EvoPlusワークフローを実施し（サイズセレクションなし）、2サイクルの増幅を行ったものをLabChip GX Touch HTとHT DNA HiSens Reagent Kit（PerkinElmer）で泳動しました。

■ゲノムDNA溶液のバッファーの種類に関わらず再現性のある酵素的断片化が可能

10 mM Tris-HClまたは10mM Tris-HCl、1 mM EDTAに溶解したヒトゲノムDNA（500 ng）を37℃で断片化したところ、どちらの条件においてもモードインサートサイズが約300 bpのライブラリーが調製されることが示されました。
この検証実験ではフルレングスアダプター（KAPA UDIアダプター）を用いたKAPA EvoPlusワークフローを実施し（サイズセレクションなし）、2サイクルの増幅を行ったものをLabChip GX Touch HTとHT DNA HiSens Reagent Kit（PerkinElmer）で泳動しました。

ライブラリー調製がより簡単に

KAPA EvoPlus Kitでは断片化とAテーリング反応を一つのステップで（Frag Tail Step）行います。
また、試薬はReadyMixとして提供されるため、ライブラリー調製はよりシンプルで簡単になり、人為的ミスのリスクが低減されます。
また、ラボのニーズによりチューブフォーマットかプレートフォーマットタイプから選択していただくことが可能となりました。

■断片化とAテーリングを統合した「Frag Tail Step」を採用

* 本キットにはアダプター試薬は含まれておりませんので、別途ご用意ください。

GCバイアスの少ない結果が得られます

■GCバイアスが小さく、物理的断片化と同等の均一なカバレッジ

各キットを使用してライブラリー調製を行いカバレッジのGCバイアスを調べたところ、KAPA EvoPlus KitはKAPA HyperPrepと同等のパフォーマンスを示す事が明らかとなりました。
酵素的断片化を用いたNEBNext® Ultra™ II FS、QIAseq FXのワークフローでは、それぞれGCリッチ領域、ATリッチ領域とGCリッチ領域の両方でパフォーマンスが低下していました。
これは断片化が均一でないことが影響しているものと考えられます。
こうしたバイアスがある場合、カバレッジホットスポットという問題が発生します（「容易な」領域（GC含量が50％に近い領域）ではカバレッジが過剰となり、「困難な」領域（AT-またはGCリッチ領域）では過小となることで、必要なカバレッジを得るために追加のシーケンスが必要となるという問題）。

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