最後のカラムからの抽出で、GP3を20 µLと少なめにしたので、2回カラムを通したのですが、回収率はどのぐらい低下しますか？

50 µL×1回と比較して、20 µL×2回ではどのくらい回収率が低下するか、との ご質問になりますでしょうか。

こちらも実際に検証しておりませんので（また、サンプル条件にも依存しますため）、 正直なところ、大変難しいご質問になります。

50 µL×1回と、20 µL×1回では、原理上は、50 μL×のほうが回収率は高くなると 予想されます。

また、20 µL×1回と、20 µL×2回では、20 µL×2回のほうが若干回収率が 向上する可能性がございます。

しかしながら、最終溶出後にメンブレンに残存してしまうデッドボリュームは、 50 µL溶出でも、20 µLでも変わりませんので、例えば20 µL×2回で濃縮した場合は、 デッドボリューム中でロスするDNA量も多くなる可能性がございます。

この度は、明確な回答が出来ず、大変申し訳ございません。

大変恐れ入りますが、もしもご不安でしたら、実際のサンプルで、あらかじめ 比較テストいただく方法は可能でしょうか。

その場合、テスト用サンプルをご用意できますので、お知らせください。