NGSライブラリー調製キット(LP Kit)

ハイパープレップキット (for illumina)(KAPA Hyper Prep Kit (for illumina))

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概要 お気軽にお問い合わせください

★★ライブラリー調製キットトライアルキャンペーン対象品★★

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特長

微量DNAサンプルからのライブラリー調製に最適 “1ng~
サンプル調製時間の短縮 “Total 2~3時間” (従来:約5時間)
新組成バッファーによるライゲーション効率の更なる向上により、インプットサンプル"100ng~"の
"PCRフリーライブラリー調整"が可能に
全ゲノムシークエンス、ターゲットシークエンス、ChiP Seqなどの微量インプットサンプルに対応
ハイフィデリティーエンジニア酵素(KAPA HiFi)による増幅バイアスの低減でシークエンスカバー率を向上
アジレント・テクノロジー社 SureSelect XTターゲットエンリッチメントシステムとの組み合わせ
(一番下をご覧ください)
により、WES(全エクソン解析)も可能

ライブラリーの収量増大とシークエンス・クオリティーの向上

ライゲーション効率の向上による高いライブラリー収量
エンジニア酵素(KAPA HiFi)による低いDuplication Rateと高いカバレッジを実現

ライブラリー作製を3時間以内に!

エンドリペアとA-テーリングの酵素反応を一元化し、SPRI精製なしでアダプターライゲーション反応へ
One-TubeワークフローによりSPRI精製ステップを最小限に減らし、PCRフリーなら2時間以内、PCR増幅を必要とする場合でも3時間以内のハンズオン・タイムを実現
最小限の操作ステップにより、ライブラリー作製の一貫性と再現性を向上

最新プロトコール SeqCap EZ HyperCap

SeqCap EZターゲットエンリッチメント・システム(ハイブリダイゼーションキャプチャー技術に基づいたシステム)のライブラリー調製ステップにおいてKAPA HyperPrep (または HyperPlus Kit) を採用する事による、ワークフロー全体の劇的な時間短縮を実現した効率的なプロトコール SeqCap EZ HyperCapがリリースされました。
本ワークフローは、アプリケーションに特化した効率的かつ合理的、そして自動化にも最適なアプローチです。


▶▶▶SeqCap EZ HyperCap ワークフローのカタログ(英語)はこちら

関連製品

FastGene Adapter Kit(イルミナ用)
・アダプター濃度が既知(30μM)のため、インプットサンプル量に応じたライゲーションの最適化が可能です
・KAPA Library Quantification Kitを用いてアダプター付加済みライブラリーDNAの定量を行うことで、製品のQCとしています

KAPA HyperPlus Kits
・断片化装置フリーの進化版キット
・インプットDNA量(1ng-1ug)やサイズに依存せず、プロトコールに記載された温度と時間のみで目的サイズに断片化でき、ワンチューブでそのままライブラリー調製まで可能な画期的なキット

SureSelect XT (アジレント・テクノロジー社)との組み合わせによる使用

組み合わせに必要な試薬については、下記のアジレント・テクノロジー社 製品ページを是非、ご覧ください。
<SureSelect XT + KAPA Hyper Prep>

FFPE や 血中 Cell Free DNA の次世代シーケンスに強力なソリューション
▶ 50 – 200 ng の FFPE DNA サンプル に対応
▶ 10 ng の高品質DNA に適用可能
▶ Cell Free DNA へ適用できる可能性
▶ 品質の低い FFPE DNA でも PCR Duplication % を抑え 高いカバレッジを実現
▶ Bravo NGS 自動化システムにも対応
▶ イルミナシーケンサ対応

アジレント・テクノロジー社 製品ページはこちら
リーフレット情報はこちら
 

文献情報

この手法を用いた実験が論文に掲載されました。

De Novo Assembly of the Transcriptome of Turritopsis, a Jellyfish That Repeatedly Rejuvenates
ZOOLOGICAL SCIENCE 33: 366–371 (2016)

仕様 お気軽にお問い合わせください

KAPA Hyper Prep Kit
【キット内容】
●エンドリペア&A-テーリングバッファー
●エンドリペア&A-テーリング酵素
●ライゲーションバッファー
●DNAライゲース
●KAPA HiFi HotStart ReadyMix
●ライブラリー増幅プライマーミックス

*アダプターは含まれておりません。
*磁気ビーズ”AMPure XP”は含まれておりません。

*PCR酵素なしのキットにはKAPA HiFi HotStart ReadyMixは含まれておりません。

【保存条件】
●-20℃で製造日より1年間保管できます。

KAPA Adapter Kit(イルミナ用)
【仕様】
濃度 30μM
容量 24インデックス 各20μl (Index No. 1-16、18-23、25、27)

【保存条件】
●-20℃
※ご注意:性能に影響するため、氷上でご使用いただくなど、出来る限り室温より低い温度でお取り扱いください

製品カタログお気軽にお問い合わせください

KAPA_illumina社用ライブラリー調整キット/日本語
公開日:2017年04月17日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:2.66 MB
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SeqCap EZ HyperCap Workflow for Target Enrichment/英語
公開日:2016年10月04日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.77 MB
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NGSライブラリー調製キットカタログ/日本語
公開日:2015年06月25日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:2.63 MB
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KAPA HyperPrep Kit&アジレント・テクノロジー Sure Select XT/日本語
公開日:2014年09月12日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:1.15 MB
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KAPA NGSライブラリー調製キット HyperPrep(イルミナ用)/英語
公開日:2014年07月28日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.47 MB
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取扱説明書お気軽にお問い合わせください

KAPA Hyper Prep Kit v5.16 日本語版補足資料/日本語
公開日:2017年01月25日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:1.56 MB
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KAPA Hyper Prep Kit v5.16/英語
公開日:2017年01月25日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.58 MB
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FastGene NGS Adapter Kit/日本語
公開日:2016年02月17日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.45 MB
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技術資料お気軽にお問い合わせください

FAQ一覧(KAPA Hyper Prep Kit)/日本語
公開日:2014年10月03日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.43 MB
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アプリノートお気軽にお問い合わせください

長期間エタノールに浸漬されたマメジカの耳片からのMtDNAの配列決定/日本語
公開日:2015年12月01日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.73 MB
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10^5個のメダカ胚由来細胞を用いた in situ Hi-C Seq/日本語
公開日:2015年07月10日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.96 MB
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FAQお気軽にお問い合わせください

インプットDNA量に応じて、ライゲーション時に使用するアダプターの濃度が変わってくるようですが、イルミナ社純正のTruSeqアダプターキットを用いる場合、濃度は何uMで計算するのでしょうか。
公表されておりませんので、濃度はあくまで推定となります。(詳細はお問い合わせください。)
私どもとしましては、Kapa社から提供されているKAPA Adapter Kit(KK8260)を
ご使用いただくことをお奨めしております。
http://www.n-genetics.com/product_detail.html?item_id=4684

 ・濃度が既知(30uM)ですので、インプットサンプル量に応じたライゲーションの最適化が可能
  
 ・Kapa社のキットを用いてライゲーション効率が品質管理されている

トラブルシュートやサポートの面も含め、やはり濃度が既知のアダプターをお使いいただいた方が
本キットの性能を最大限に生かすことが出来ます。

PCRフリーでライブラリー調製を行った場合、インサートの両側にアダプターが正しくライゲーションされなかったものも残存します。
この場合、ライブラリー濃度をqPCRで定量すれば、シーケンスに影響しないでしょうか。
ライブラリー増幅(PCR)の有無にかかわらず、インサートの両側にアダプターが正しくライゲーションされなかったものは残存いたします。
確かにPCR増幅した場合、両側にアダプターが付いたライブラリーのみ増幅しますので、サイクルごとに全体に対する割合は減少いたしますが、依然として残存はしております。

この両側にアダプターがライゲーションしなかったライブラリーは、フローセル上でブリッジPCRが掛かりませんので、シーケンスに必要なクラスターを形成しません。
ですので、基本的にはシーケンスデータには影響いたしません。
しかし、qPCR以外の方法で濃度測定すると、正しくアダプターが結合したライブラリーとの区別がつかないため、適切な濃度でフローセルに添加したつもりでも、実際に形成されるクラスター数が少なくなってしまい、結果的にデータ量が少なくなってしまいます。

このため、qPCRでライブラリー濃度を定量いただくことで、いずれの場合でも、両側にアダプター配列を持つ正しいライブラリーの濃度が測定でき、結果として安定したクラスター数が得られます。

ライゲーション効率が改善されたとの記載がありますが、従来のライブラリー 調製(LP)キット(KK8200)のシリーズと比較しても変更されているのでしょうか。
KAPA社 Hyper Prep Kitは、これまでの製品よりも効率が改善されております。
  
アダプターのライゲーションまでには「エンドリペア」「Aテーリング」「ライゲーション」3種類の酵素が使用されております。
これまでのキットをご採用いただいた方には、こちらの酵素自体の性能を高くご評価いただいておりました。
HyperPrepKitでは、これらの酵素自体はこれまでのキットと全く同じ酵素が使用されております。
しかし、プロトコールと反応バッファーを改善することで、よりサンプルロスのリスクが少なく、更に効率的なライゲーションが実施できるよう工夫されております。

illumina社シークエンサー用KAPA Hyper Prep Kitの推奨用途は?
・全ゲノムショットガン法
・Agilent SureSelect、Roche Nimblegen™、illumina® TruSeq™、IDT xGen™ Lockdown™ Probes等を利用したエクソームまたはカスタムキャプチャーによるターゲットシークエンシング
・アンプリコンシークエンシング
・ChIP-seq解析
・RNA-seq解析
・Methyl seq解析(KAPA HiFi Uracil+ Library Amplification Ready Mixと併用を推奨)

必要なインプット量は?
本プロトコールでは、ライブラリー作製に用いるサンプルとして、適切に断片化された二本鎖DNAを1ng~1μg用いるのが有効とされています。ただし、最終的なライブラリーのカバレッジと複雑性を確保する上で十分なコピー数を含むサンプルであれば、これより少ないインプット量でライブラリーを作製することも可能です。

ライブラリー作製プロセスの主な工程は?
・エンドリペア、Aテーリング: 末端が修復され、5'末端にリン酸基、3'末端にdAテールを有する二本鎖DNA断片を作製します。
アダプターライゲーション: 3'-dTMPオーバーハングを有する二本鎖DNAアダプターを、3'-dAテールを有するライブラリー断片にライゲーションします。
ライブラリー増幅(オプション): 正確性が高くバイアスの少ないPCRにより、両端に適切なアダプター配列を有するライブラリー断片を増幅します。

ライブラリー作製プロセスの途中で作業を中断しても大丈夫ですか?
経験やサンプル数にもよりますが、ライブラリー作製の全工程(エンドリペア、Aテーリングから最終的なライブラリー増幅まで)は3時間以内に完了できます。プロトコールの途中で作業を中断したい場合は、ライゲーション後の精製が完了した後、もしくはライブラリー増幅直後(精製前)であれば中断しても問題ありません。
アダプター付加済みのライブラリーは、4℃で1週間または-20℃で1ヶ月以上保存でき、その後増幅、ターゲットエンリッチメント、シークエンシングに使用できます。DNAの分解を防ぐため、必ずバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0)中で保存し、凍結融解の繰り返しはできるだけ避けて下さい。

断片化処理の推奨条件は?
・断片化処理とエンドリペアの間に精製を行う場合は、TEバッファー(10 mM Tris-HCl(pH 8または8.5)+1 mM EDTA)中で断片化を行って下さい。
・断片化処理とエンドリペアの間に精製を行わない場合は、Low TEバッファー(10 mM Tris-HCl (pH 8または8.5)+0.1 mM EDTA)中で断片化を行って下さい。
(注意)PCR grade waterなど、水を用いてDNAの断片化を行わないで下さい。

FFPEサンプルを使用する場合に推奨されるワークフローはありますか?
特にありません。 標準プロトコールに従ってターゲットキャプチャー用FFPEライブラリーを作製して下さい。WGSワークフローでは、恐らくサイズセレクションが必要になるでしょう。

断片化DNAのアダプター付加済みDNAへの変換率は?
断片化DNAのアダプター付加済みDNAへの変換率は、インプット量が少ないほど低くなります。ライブラリー作製の最初の工程(エンドリペア、Aテーリング)で>10 ngの断片化ゲノムDNAから始めると、通常はインプットDNAの5%から35%がアダプター付加済みDNAとして回収されます。ライブラリー増幅の前にSPRI®精製の回数を増やしたり、サイズセレクションを実施すると、アダプター付加済みDNAの収量が低くなる傾向があります。

アダプターライゲーション後、SPRI 精製を何回実施すればよいですか?
新たに開発されたone-tube KAPA Hyper Prepケミストリーが、アダプターダイマー形成やキャリーオーバーの頻度を軽減してくれますので、アダプターライゲーション後、SPRI精製を1回行えば、未反応のアダプターやアダプターダイマーは十分除去されます。インプット量が少ないアプリケーションで推奨される高い「アダプター:インサート」モル比でも、十分除去が可能です。

本プロトコールはサイズセレクションにも対応していますか?
必要に応じて、一般的手法によるサイズセレクション(デュアルSPRI、電気泳動法など)をプロトコールに組み込むことが出来ます。
・ワークフロー全体を通して、サイズセレクションを実施できるポイントはいくつかあります。例えば:
・断片化DNAのエンドリペアの前
・ライゲーション後精製の後
・ライブラリー増幅の後
KAPA Hyper Prepの標準プロトコールにはサイズセレクション工程は含まれていません。ライブラリー作製前、ライゲーション後、あるいはライブラリー増幅後にデュアルSPRIサイズセレクションを実施する場合の詳細な手順については、KAPA Hyper Prepのテクニカル・データ・シートのAppendix をご覧下さい。

増幅に使われている酵素は何ですか?
KAPA Hyper Prep Kitは、ライブラリー増幅試薬としてKAPA HiFi HotStart ReadyMixを含んでいます。この試薬には、増幅時のバイアスが少なく、効率的で正確性が高いKAPA社エンジニア酵素(BファミリーHiFi HotStart DNAポリメラーゼ)が含まれています。KAPA HiFiは、NGSライブラリー増幅に理想的な酵素です(1、2、3、4)。
1. Oyola, S.O. et al. BMC Genomics 13, 1 (2012) 2. Quail M.A. et al. Nature Methods 9, 10-11 (2012) 3. Quail M.A. et al. BMC Genomics 13, 341 (2012) 4. Ross, M.G. et al. Genome Biology 14: R51 (2013)

ライブラリー増幅は必須ですか?
ライゲーション後の精製実施後に回収されたアダプター付加済みのライブラリーが、次のプロセス(ダイレクトシークエンシングなど)を実施する上で十分量であり、かつライブラリーがそのプロセスに必要なアダプターをすべて有していれば、ライブラリー増幅を省略しても構いません。ワークフローがさらに簡素化され、ライブラリー作製の所要時間が2時間以内に短縮されます。KAPA Hyper Prep Kitは高い転換率を誇るため、最小100 ngのインプットDNA量でPCRフリーのワークフローを実現可能です。PCRフリーワークフロー向けに、増幅試薬を含まないKAPA Hyper Prep Kit(KK8501、KK8503及びKK8505)もあります。

KAPA Library Amplification Primer Mixは すべてのilluminaライブラリーに対応していますか?
KAPA Hyper Prep Kitには、新たに最適化されたLibrary Amplification Primer Mixが含まれており、KAPA HiFi DNAポリメラーゼによるライブラリー増幅反応中のプライマー枯渇を防止します。ミックス中に含まれるプライマーはillumina®フローセル配列P5及びP7を保有しており、完全なアダプター配列を付加されたライブラリーの増幅に適しています。また、キット以外のプライマーミックスも、不完全またはカスタムアダプターと組み合わせて使用できます。

ライブラリーの過剰増幅を検出するにはどうすればよいでしょう?
ライブラリー増幅反応では、通常、dNTPより先にプライマーが枯渇します。基質の枯渇によりそれ以上DNA合成が行われなくなると、その後のDNA変性やアニーリングステップで相補鎖が分離し、非相補鎖への不完全なアニーリングが起こります。異常アニーリングの結果、部分的に二本鎖を形成するヘテロ二本鎖DNAが大量に集まり、いわゆる「daisy-chains」や「tangled knots」が形成されます。このようなDNAは泳動速度が遅いため、増幅されたライブラリーを電気泳動で解析すると、高分子量の位置に二次的なピークとして検出されます。

過剰増幅はどのような影響をもたらしますか?
ライブラリーの過剰増幅は、PCRデュプリケーション、ライブラリーインサートのキメラ化、増幅バイアスやヘテロ二本鎖DNAの形成など、望ましくない副産物を生じてしまいます。QCやシークエンシングを行うのに十分なライブラリー量は確保しつつ、できるだけ増幅を抑えることが好ましいです。

調製されたライブラリーの品質を評価する方法は?
電気泳動により、ライブラリーのサイズ分布、及びプライマーダイマーや過剰増幅産物の有無を確認します。ターゲットキャプチャーやシークエンシングのためにプールする前に、KAPA Library Quantification KitでqPCRを行いライブラリーを定量することをお勧めします。アダプター付加済みのライブラリー(ライブラリー増幅前)をqPCRで定量することは、プロトコールの最適化やトラブルシューティングにも有効です。

KAPA Hyper Prep Kitの使用期限は?推奨される保存条件は?
本キットに含まれている酵素は温度に敏感ですので、輸送及び保存の際は適切な温度管理が必要です。KAPA Hyper Prep Kitは、送り先によってドライアイスやアイスパック等を同梱して出荷されます。受領後、酵素及び反応バッファーを直ちにフリーザーに入れ、-20℃で保存して下さい。保存条件を守って適切に扱えば、ラベルに記載された使用期限(出荷日から12ヶ月後)までキット内容物の活性が落ちることはありません

Ligation bufferを使用する際、溶液中に液滴のようなものが沈殿していました。
これは何でしょうか?
このまま使用しても問題ないでしょうか?
Ligation Bufferに含まれるPEG6000が凍結融解時に液滴として見られることがございます。
Kapa社での開発テストでも使用上問題ないことが確認されておりますが、念のためにご使用前に室温に戻し、ピペッティングした後にボルテックスし、均質化してください。
反応液として調製いただくと、通常この液滴は見られなくなります。

キットの保存方法について質問です。
1回のランで数サンプルしかライブラリー調製しないため、1キットを使い切るのに6か月以上かかり、キットを-20℃で保存すると、合計10回程度の凍結融解を繰り返してしまう計算になります。
凍結融解を繰り返すことで、キットの性能が劣化することが心配ですが、キットをどのように保存したらよいでしょうか?
KAPAHyperPrepキットの個々の試薬(マスターミックスに調製していない状態)は、
20回まで(少なくとも10回)は凍結融解を繰り返しても性能に影響しません。
ですので、凍結融解20回程度まででしたら、基本的には-20℃(-15℃~-20℃)で保存することをお奨めします。

また、4℃の場合でも、1か月は安定して保存ができます。
このため、凍結融解の頻度を考慮して、どちらの保存方法にするか選択ください。

その他、凍結融解後の使用前の注意点について、取扱説明書を十分にご確認ください。

お知らせお気軽にお問い合わせください

FastGene™ NGSアダプターキット販売中止のご案内/日本語
公開日:2017年04月03日
ファイル形式:pdf
ファイルサイズ:0.15 MB
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オーダー情報

在庫有り(6個以上) 在庫わずか(1~5個) お問い合わせください 受注発注品 別途送料請求あり 在庫無くなり次第販売中止 販売中止 返品不可
CatNo. 概要 単位 価格 在庫
KK8500 KAPA Hyper Prep Kit / 8反応分 1キット オープン価格
KK8502 KAPA Hyper Prep Kit / 24反応分 1キット オープン価格
KK8504 KAPA Hyper Prep Kit / 96反応分 1キット オープン価格
KK8501 KAPA Hyper Prep Kit / PCR酵素なし / 8反応分 1キット オープン価格
KK8503 KAPA Hyper Prep Kit / PCR酵素なし / 24反応分 1キット オープン価格
KK8505 KAPA Hyper Prep Kit / PCR酵素なし / 96反応分 1キット オープン価格
FastGene Adapter Kit(イルミナ用)
FG-NGSAD24 FastGene Adapter Kit (24インデックス No.1-16, 18-23, 25, 27 各20ul)
販売中止
1キット オープン価格

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