| Bridge-ItTM Fluorescence Assay Kit |
| CatNo |
製品名 |
フォーマット |
反応数 |
価格 |
（税込価格） |
| MM122934 |
cAMP designer |
96Well用 |
50 |
\46,000 |
(\48,300) |
| MM122935 |
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96Well用 |
96 |
\86,000 |
(\90,300) |
| MM122938 |
cAMP all in one |
384Well用 |
384 |
\177,000 |
(\185,850) |
| MM122939 |
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384Well用 |
768 |
\290,000 |
（\304,500） |
| MM122940 |
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384Well用 |
1152 |
\406,000 |
（\426,300） |
| MM122937 |
10xKRB-IBMX buffer |
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\2,300 |
(\2,415) |
| MM163300 |
96well Black Plate |
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\2,300 |
(\2,415) |
| MM163301 |
384well Black Plate |
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\3,400 |
(\3,570) |
| 特長 |
−特異的なリガンド（cAMP）により活性化する
「DNA結合タンパク質」を利用したアッセイシステム
（抗体を使用しません）
−簡便で早いプロトコル（ホモジニアスアッセイ）
−高い特異性と再現性
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| 保存条件 |
-20℃で1年間保存可能です。
融解後は4℃で1週間保存できます。
（凍結融解不可）
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| キット概要 |
本キットはcAMPをリガンドとして活性化するバクテリア由来のDNA結合タンパク質であるCAPタンパク質を特異性の高いバイオセンサーとして利用したcAMP測定キットです。
Bridge-ItTM cAMP designer Assay Kit（96wellフォーマット用）
Bridge-ItTM cAMP all in one Assay Kit（384wellフォーマット用） |
| 特異性および感度 |
ATP、AMP、cGMPに対する非特異性な反応について試験した結果、実サンプルで問題となる濃度範囲（ATP、AMP：ｍMレベル、cGMP：μMレベル）において、非特異的な検出はみられませんでした。
Bridge-ItTM cAMP designerとBridge-ItTM cAMP all in one Assayの感度および性能特性を下表と図に示します。 |
| Bridge-ItTM cAMP |
使用プレート |
cAMP 検出 レベル |
| designer |
96-well |
5nM (0.5 pmol/well in 100 μl vol.) |
| all in one |
384-well |
5nM (100 fmol/well in 20 μl vol.) |
| 細胞調製とフォルスコリン刺激 |
HEK-293細胞を通常の細胞培養条件で70〜80%のコンフルエントまで培養しました。細胞をトリプシン処理した後、回収し、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む無血清のクレブスリンゲル重炭酸バッファー（KRB-IBMXバッファー）で洗浄しました。フォルスコリンで細胞を刺激した後、Bridge-ItTM cAMP all in one AssayまたはBridge-ItTM cAMP designer Assayを用いてcAMPレベルを測定しました。Bridge-ItTM Assay Solutionを添加して25℃で30分間インキュベーションした後、蛍光シグナルを波長520nm（励起光480nm）で測定しました。ブランクに対するシグナル変化量として相対蛍光値(RF)(RF=(F0-F)/F0)を用いてデータを解析しました。RF分析の結果、アッセイが高い再現性を持つこと、蛍光の測定に使用する装置には影響を受けないことが分かりました。
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| ■懸濁させた細胞を用いたBridge-ItTM cAMP all in one アッセイキット使用例 |
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| ■懸濁させた細胞を用いたBridge-ItTM cAMP designer アッセイキット使用例 |
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| ■接着細胞を用いたBridge-ItTM cAMP designer アッセイキット使用例 |
Bridge-ItTM cAMP all in oneまたはdesigner Assayキットにより、マイクロプレートに接着した状態で細胞内のcAMPを刺激し、測定することもできます。
・HEK-293細胞をトリプシン処理し、培地100μl中の細胞数が25,000個になるよう調整
・96ウェルポリスチレン製培養プレートの各ウェルに100μlずつ播種し、一晩培養
・翌日、培地を取り除き、50μlのKRB-IBMXバッファーと交換
・各濃度のフォルスコリンを加え、マイクロプレートを25℃で15分間インキュベーション
・Assay Solutionを各ウェルに添加
・プレートをローテーターで緩やかに振とうしながら25℃で30分間インキュベーション
・ウェル中の溶液を96ウェルブラックプレートに移し、フルオロセインの設定（励起：480nm、蛍光：520nm）で蛍光シグナルを測定 |
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