制限酵素には、Hind IIIとBam HIのように、FastCut Bufferを1Xで使うものと2Xで使うものがあるようです。 FastCut Buffer推奨濃度の異なる酵素を使用したDouble Digestionは、どのように進めればよいでしょうか？

２種類の酵素で、FastCut Buffer推奨濃度が異なる場合には、２段階で反応を進めることを推奨しております。

 

以下に、Hind IIIとBam HIで行う際の反応プロトコルを記載いたします。

こちらをご参照にご実施ください。

 

1) 1st digestion

DNA      1 µg (~10 µL)

10X FastCut buffer          5 µL

Hind III (20 unit/µL)        1 µL

Sterile water         up to 50 µL

→ Incubate at 37℃ for 15 min

→ Incubate at 65℃ for 20 min (heat inactivation)

 

2) 2nd digestion

1st reaction mixture       50 µL

*10X FastCut buffer         7 µL

Bam HI (20 unit/µL)         1 µL

Sterile water         up to 60 µL

→ Incubate at 37℃ for 15min