作成ライブラリーの濃度を定量するために、ライブラリー定量キット、および、Qubitを用いて定量しました。 この結果、ライブラリーキットを用いて得られたライブラリーの濃度が、Qubitを用いた核酸濃度測定結果と比較して、大きくなりました。 一般的には、逆だと思うのですが、どのような原因が考えられるのでしょうか？

ヘテロ二本鎖DNAで構成されるライブラリーとなっている可能性が考えられます。

 

ライブラリー定量キットを用いた場合、アダプターが付いたDNAを定量しているため、Qubitなど二本鎖DNAの濃度定量結果と比較して、低く見積もられることがほとんどです。

しかしながら、ライブラリー作成の際、過剰増幅などが原因でPCR反応基質が枯渇すると、十分に相補鎖が合成されず、部分的に一本鎖DNAとなってしまっているDNA（ヘテロ二本鎖DNA）を多く生じる場合がございます。

このとき、Qubitの測定などで得られる二本鎖DNA濃度は低く見積もられ、ライブラリー定量キットの定量結果は大きく見積もられます。

 

ライブラリーがヘテロ二本鎖DNAになっている可能性が疑われる場合、PCRプライマーを添加し、数サイクル追加でPCRを行うことにより、本現象は解消する場合がございます。